石蠟切片tunel實驗染凋亡細胞-上海鄭核

一、實驗器材及試劑

1、實驗器材

名稱 廠家 型號

脫水機 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J

包埋機 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5

病理切片機 上海徠卡儀器有限公司 RM2016

凍臺 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5

組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P

烤箱 上海?，攲嶒瀮x器有限公司 DGX-9003B

載玻片 Servicebio

掌上離心機 Servicebio D1008E

脫色搖床 Servicebio TSY-B

渦旋混合器 Servicebio MX-F

移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573

顯微鏡 CIC XSP-C204

組化筆 Gene tech GT1001

2、主要實驗試劑

試劑 廠家 貨號

二甲苯 國藥集團化學(xué)試劑有限公司

無水乙醇 國藥集團化學(xué)試劑有限公司

PBS緩沖液 Servicebio G0002

蛋白酶K Servicebio G1205

破膜液 Servicebio G1204

3%雙氧水 Servicebio G0115

蘇木素染液 Servicebio G1004

蘇木素分化液 Servicebio G1039

蘇木素反藍液 Servicebio G1040

中性樹膠 Servicebio G1403

Tunel試劑盒 Roche 11684817910

DAB顯色劑 Servicebio G2111

二、石蠟切片tunel實驗步驟

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗。

2、修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育25min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃水浴鍋孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。

5、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

6、加試劑3：切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3(converter-POD）覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

7、DAB顯色：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為細胞核呈棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。

8、復(fù)染細胞核：蘇木素復(fù)染3min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。

9、脫水封片：將切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

三．結(jié)果判斷

蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出來的陽性凋亡細胞核為棕黃色

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